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背景介紹

目前的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)只能獲得群體的遺傳或表達(dá)信息，而無法區(qū)分細(xì)胞間的差異，單細(xì)胞測序技術(shù)可以研究單個細(xì)胞或基因的表達(dá)情況，從而研究細(xì)胞異質(zhì)性，也可以獲得基因表達(dá)、剪接等信息以及根據(jù)這些信息構(gòu)建的調(diào)控關(guān)系。因此，在實驗之前要進(jìn)行合理、細(xì)致的實驗設(shè)計，避免一些混雜因素（confounding factors）的影響并基于生物學(xué)的變異得出可靠的結(jié)論，防止批量操作時引入人工產(chǎn)物影響實驗結(jié)果。

本文基于兩種主流的單細(xì)胞RNA測序技術(shù)：Smart-seq2和10X Genomics 3’ sequencing，討論了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的實驗設(shè)計原則和注意事項，并對兩種方法的優(yōu)缺點進(jìn)行比較分析。

02

兩種方法：Smart-seq2和10X Genomics 3’sequencing的比較

（1）SMART技術(shù)：Smart技術(shù)是基于高保真的反轉(zhuǎn)錄酶、模板轉(zhuǎn)換和前置放大來增加cDNA得率，實驗流程2天，得到的是全長轉(zhuǎn)錄本。該方法有較好的覆蓋范圍，可檢測到稀有轉(zhuǎn)錄本，不需要額外的專業(yè)設(shè)備，因此應(yīng)用范圍較廣。但是該方法不適合大批量實驗（如96甚至384個樣本）。

（2）10X Genomics 3’sequencing ：該方法基于微流控技術(shù)（Microfluidics-based approaches），與Smart有相似的分子生物學(xué)原理，運(yùn)用了模板轉(zhuǎn)換技術(shù)，但與Smart的細(xì)胞捕獲和通量不同。droplet-based方法是將單個細(xì)胞包裹在一個小油滴中（含有barcode和RT primer）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后油滴破裂釋放cDNA，統(tǒng)一進(jìn)行文庫構(gòu)建，增大了實驗通量，但需要專門的實驗設(shè)備，如BioRad的ddSeq single-cell isolator（用Illumina Nextera kits）；Fluidigm C1 platform的低通量的微流控技術(shù)，能在捕獲細(xì)胞時可視化的控制empty wells or doublets。但目前最主流的是10X Genomics。

兩種方法的比較如下：

C、D、E：10x data F、G、H：Smart data

（1）從Fig.1A可知，兩種方法最大的區(qū)別是RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法：分別是全長mRNA和3’尾測序，研究表達(dá)量較低的RNA可以選擇smart的全長測序，而3’端測序可以得到更多的細(xì)胞，從而得到一個細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。

（2）spike-in control是常用的評估技術(shù)差異的方法, Lun et al.的研究發(fā)現(xiàn)spike-in control 在確定測序過程中的empty Wells和的dead cells有重要作用，因為高的ERCC含量與低質(zhì)量數(shù)據(jù)相關(guān)，并且通常是排除的標(biāo)準(zhǔn)。

Spike-in：A molecule or a set of molecules introduced to the sample in order to calibrate measurements and account for technical variation; commonly used examples include external RNA control consortium (ERCC) controls (Ambion/Thermo Fisher Scientific) and Spike-in RNA variant control mixes。一個分子或一組分子引入到樣品中以校準(zhǔn)測量并解釋技術(shù)變化；常用的例子包括外部RNA控制聯(lián)合體（Ercc）和spike-in RNA變體控制混合物。

(3)10x捕獲到的細(xì)胞數(shù)量更多，實驗設(shè)計的不同會使文庫大小相差幾個數(shù)量級（Fig.1C,F）

（4）Smart-seq2 可以得到更多的基因信息（Fig.1G,D）

（5）Smart-seq2數(shù)據(jù)集比10x更復(fù)雜（Fig.1E,H）

總之，10x更加方便，簡少了人工操作，簡化了大量細(xì)胞的數(shù)據(jù)收集。但細(xì)胞數(shù)的增加導(dǎo)致測序深度也增加，犧牲了文庫的復(fù)雜度，丟失了固定的工作流程。

03

實驗設(shè)計

（1）避免技術(shù)偏差

成功的測序?qū)嶒炘O(shè)計 應(yīng)遵循三個原則：生物學(xué)重復(fù)、隨機(jī)分組和平衡區(qū)組設(shè)計（a balanced block design），見圖2.

在一個混雜的（confounded design）設(shè)計中，來自單個小鼠/條件組的細(xì)胞將被分揀到單個板上，并且該板上的細(xì)胞文庫將在一個批次中制備。最后，在一條lane中測序，而另一個條件下的文庫則在另一條lane中測序。在這個例子中，不可能分辨出基因表達(dá)的差異是因為實驗條件還是混雜的/不均衡的實驗設(shè)計引入的技術(shù)差異。這個實驗可以使用平衡組區(qū)重新設(shè)計，保證每個樣本的六個小鼠和測序儀的每一條lane都有樣本。

Smart-seq2 允許選擇individual wells填充細(xì)胞，很容易實現(xiàn)平衡組區(qū)的方法。對于10x，需要確保在初始封裝過程中處理不同芯片上的樣品，并進(jìn)一步進(jìn)行下游處理以平衡實驗。

（2）決定合適的細(xì)胞數(shù)目和測序深度

回收細(xì)胞數(shù)目可以根據(jù)樣本中所有細(xì)胞的預(yù)期異質(zhì)性、樣本內(nèi)特定細(xì)胞類型所期望的最小頻率和在所得到的數(shù)據(jù)集中期望的每種類型的細(xì)胞的最小數(shù)目來估計?？梢岳秘?fù)二項分布評估稀有樣本的細(xì)胞數(shù)目。例如，如果我們要測序好友10個細(xì)胞類型的樣本，但稀有細(xì)胞的頻率只有0.03，我們就需要對2200個細(xì)胞進(jìn)行測序，以保證90%的機(jī)會捕獲到50個稀有細(xì)胞。一個實驗室：Satija lab，可以提供在線工具（www.satijalab.org/howmanycells），基于細(xì)胞類型和多樣性評估目標(biāo)細(xì)胞數(shù)目。

每個實驗的測序深度的準(zhǔn)確估計需要預(yù)知個體細(xì)胞中的總mRNA含量和這些細(xì)胞中mRNA物種的多樣性。但這些參數(shù)往往很難預(yù)估。在最近發(fā)表的研究中提供了一個有用的指導(dǎo)方針，他們用16個不同的protocol和五個物種進(jìn)行了34個獨特實驗，對這些單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了全面的分析。他們發(fā)現(xiàn)，每個細(xì)胞有250 000個reads就足夠準(zhǔn)確，每個細(xì)胞的100萬個讀取是飽和基因檢測的好目標(biāo)。但具體的測序深度因?qū)嶒炘O(shè)計差異和物種不同而做適當(dāng)調(diào)整。

END